蛋白與蛋白相互作用分析—免疫共沉淀
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     實驗原理

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗體和抗原之間的特異性結(jié)合以及細菌蛋白質(zhì)的“protein A/G"特異性地結(jié)合抗體Fc段的現(xiàn)象而開發(fā)出來的方法，是研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，主要用于確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)是否存在生理性相互作用。其原理是：當細胞在非變性條件下裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用可以被保留下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體進行免疫沉淀，那么在細胞內(nèi)與X結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能被沉淀下來。目前多將精制的protein A/G預(yù)先結(jié)合固化在agarose beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的protein A就能吸附抗原及其結(jié)合蛋白，通過低速離心，可以將目的抗原及其結(jié)合蛋白與其它成分分離。

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實驗步驟

1.轉(zhuǎn)染24-48 h后，刮取細胞，轉(zhuǎn)移到15mL離心管，1000rpm離心5min，用冰預(yù)冷的PBS洗滌細胞一次，細胞沉淀用1mL冰預(yù)冷的PBS重懸，移至Eppendorf管，4°C 12000rpm離心1min，棄上清；

2.加入適量NP-40細胞裂解緩沖液（用前新鮮加入蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min, 每隔10min Vortex一次 (每次大約30sec)，4℃ 12000rpm離心1 min，上清移至新的Eppendorf管；

3.蛋白定量，每組取適量（通常100μg-1mg）蛋白，用細胞裂解液調(diào)整體積使每組一致（通常總體積500-1000μL），加入40 μL (50% 懸浮液) Protein A/G瓊脂糖珠；

4.4°C孵育30min – 2h，以去除蛋白與Protein A/G瓊脂糖珠的非特異結(jié)合（pre-clear）；

5.4°C，2500rpm 離心3 min，上清移至新的Eppendorf管；

6.加入第一抗體，4°C旋轉(zhuǎn)孵育過夜；

7.次日，每管加入40 μL (50% 懸浮液) Protein A/G瓊脂糖珠，4°C緩慢旋轉(zhuǎn)孵育1–3h；

8.4°C，2500rpm 離心3 min，小心吸去上清，瓊脂糖珠用1mL裂解緩沖液洗3－4次；每次可樣品置于4°C緩慢旋轉(zhuǎn)孵育10min；

9.最后一次吸干所有液體，加入40μl的1×SDS 上樣緩沖液，Vortex，然后用離心機輕甩30sec；

10.沸水煮5分鐘，12,000rpm離心1min；

11.SDS-PAGE并進行Western blot檢測。

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注意事項

1．本實驗需要在4°C進行。

2．細胞裂解采用溫和的裂解緩沖液，不能破壞細胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100)。

3．為防止蛋白的降解，細胞裂解緩沖液必須新鮮加入蛋白酶抑制劑，如Roche的cocktail inhibitor。

4．要注意抗體的選擇，并不是所有抗體都適合做IP，需要仔細檢查抗體的說明書，說明書上標注適用于IP的才行。

5．要使用對照抗體，以確保共沉淀的蛋白是由所加入的特異性抗體沉淀得到的，而不是與抗體的非特異結(jié)合。

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個人心得

1.通常孵育時溶液的總體積小于離心管容積的1/2，這樣有利于溶液的充分混合以保證抗原抗體的充分結(jié)合。

2.蛋白裂解液與抗體孵育后，加入Protein A/G瓊脂糖珠前，可對Protein A/G瓊脂糖珠用蛋白裂解液洗滌一次，可將幾組需要的瓊脂糖珠一并進行洗滌，然后用蛋白裂解液重懸后再平均分到各組，這樣可以避免每管所加瓊脂糖珠在體積上的差異。

3.檢測過表達蛋白的相互作用，用標簽抗體進行免疫沉淀比較容易，細胞裂解液需要的量較少（100-200μg）；而檢測內(nèi)源性蛋白的相互作用，細胞裂解液需要的量較多（1-5mg），并且對抗體的要求更高，務(wù)必確定該抗體適用于做免疫沉淀，選擇好用的抗體，最好參考文獻。

4.檢測過表達蛋白的相互作用，轉(zhuǎn)染24h后就可有高水平的表達，但通常我們選擇轉(zhuǎn)染后36h收細胞進行實驗。

5.先將細胞裂解液與抗體孵育，再與Protein A/G瓊脂糖珠孵育是一種方法，也可將抗體先與Protein A/G瓊脂糖珠孵育，再與pre-clear過的蛋白裂解液孵育也是可行的。二者在結(jié)果上沒有明顯差別。

6.洗滌可以將樣品置于4°C緩慢旋轉(zhuǎn)孵育5-10min，也可手工顛倒混勻，然后放于冰上，重復幾次，感覺前者比較方便。

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NP-40裂解液配方（100ml）

NaCl:               0.8766g

NP-40:              0.5ml

Tris-Hcl:            Tris-Hcl:0.6057g;  Hcl:210ul

去離子水補齊至100ml

                                                                                                                                         本篇轉(zhuǎn)至實驗之家